detección de hongoS micorrícicoS arbuSculareS  
en la hojaraSca de diStintaS eSPecieS arbóreaS:  
evaluación de treS técnicaS de clarificación  
detection of arbuScular mycorrhizal fungi in the litter of  
different tree SPecieS: review of three clarification techniqueS  
1
1,2  
1,2  
& Vanesa A. Silvani  
Sofía Crescio * , Alicia M. Godeas  
Summary  
Background and aims: Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are obligate symbionts  
with plant roots, and they colonize the surrounding soil and leaf litter. A unique  
clarification technique has been used for studying AMF in decomposing leaves, but  
it is not optimal for all types. This study aimed to evaluate and adjust three clearing  
techniques on leaf litter of diverse plant species for the detection of AMF structures.  
M&M: We collected leaf litter of Quercus robur, Tipuana tipu, Ulmus minor, Fraxinus  
pennsylvanica, Platanus acerifolia, Laurus nobilis, Populus alba and Melia azedarach  
from soil surface of two parks in Buenos Aires (Argentina). Also, we inoculated leaf  
litter of F. pennsylvanica with Rhizoglomus intraradices in a pot culture under semi-  
controlled conditions. Three clarification techniques were tested: the “5-5-5 staining  
technique” by Arambarri, the root clarification technique by Phillips & Hayman,  
and Peterson et al. The time and temperature to reagent exposure were adjusted  
according to each decomposing leaf.  
Results: The clarification technique of Peterson et al. was the most appropriate for  
all the tested leaf litters. An effective clarification, conservation of leaf structure and  
visualization of extraradical spores and mycelia of AMF was achieved.  
Conclusions: The selection of the appropriate technique greatly depends on the  
quality and composition of leaf litter. By the optimization of Peterson et al. technique,  
we were able to detect structures ofAMF on decomposing leaves of F. pennsylvanica  
and T. tipu.  
1
. Laboratorio de Microbiología  
del Suelo, Departamento  
de Biodiversidad Biología  
y
Experimental, Facultad de Ciencias  
Exactas y Naturales, Universidad de  
Buenos Aires. Argentina  
2
. Instituto de Biodiversidad y  
Biología Experimental y Aplicada,  
UBA-CONICET, Facultad de Ciencias  
Exactas y Naturales, Universidad de  
Buenos Aires. Argentina  
*sofiacrescio.r@gmail.com  
Citar este artículo  
CRESCIO, S., A. M. GODEAS & V.  
A. SILVANI. 2023. Detección de  
hongos micorrícicos arbusculares  
en la hojarasca de distintas  
especies arbóreas: evaluación de  
tres técnicas de clarificación. Bol.  
Soc. Argent. Bot. 58: 177-186.  
Key wordS  
Arbuscular mycorrhizal fungi, clarification techniques, fungal structures, histochemistry,  
DOI: https://doi.  
org/10.31055/1851.2372.v58.  
n2.37810  
leaf litter.  
reSumen  
Introducción y objetivos: Los hongos micorrícicos arbusculares (HMA) son  
simbiontes obligados de las raíces de las plantas y se desarrollan en el suelo y  
hojarasca. Hasta el momento, se ha empleado una única técnica de clarificación  
en hojarasca para el estudio de los HMA, pero, es necesario analizar otras  
metodologías de acuerdo con las diferencias anatómicas y bioquímicas de las hojas.  
En este trabajo se evaluaron y ajustaron tres técnicas de clarificación en hojarasca  
de distintas especies arbóreas para la detección de HMA.  
M&M: Se recolectó hojarasca de Quercus robur, Tipuana tipu, Ulmus minor, Fraxinus  
pennsylvanica, Platanus acerifolia, Laurus nobilis, Populus alba and Melia azedarach  
de la superficie del suelo en dos parques de la ciudad de Buenos Aires. Además, se  
inoculó hojarasca de F. pennsylvanica con Rhizoglomus intraradices en un cultivo  
bajo condiciones semicontroladas. Se evaluaron tres técnicas de clarificación: “5-5-  
5” de Arambarri, Phillips & Hayman, y Peterson et al., y se ajustaron modificando la  
duración y temperatura de exposición a los reactivos.  
Resultados: La técnica de clarificación propuesta por Peterson et al. fue la más  
apropiada para todas las hojarascas evaluadas. Se obtuvo una eficaz clarificación,  
conservación de la estructura foliar y visualización de esporas e hifas de HMA.  
Conclusión: La selección adecuada de la técnica depende de la calidad de  
la hojarasca. La optimización del método de Peterson et al. permitió detectar  
estructuras de HMA en la hojarasca de F. pennsylvanica y T. tipu.  
Recibido: 31 May 2022  
Aceptado: 25 Ene 2023  
Publicado en línea: 31 Mar 2023  
Publicado impreso: 30 Jun 2023  
Editora: María Victoria Vignale  
PalabraS clave  
Clarificación, estructuras fúngicas, histoquímica, hojarasca, hongos micorrícicos  
arbusculares.  
ISSN versión impresa 0373-580X  
ISSN versión on-line 1851-2372  
177  
Bol. Soc. Argent. Bot. 58 (2) 2023  
introducción  
HMA desarrolladas en la hojarasca, es la técnica  
de clarificación y tinción descrita por Phillips &  
Los hongos micorrícicos arbusculares (HMA) Hayman (1970) (Aristizábal et al., 2004; Bunn et  
pertenecientes al Phylum Glomeromycota, al., 2019; Díaz Ariza et al., 2021). Esta técnica  
establecen asociaciones simbióticas mutualistas se basa en la inmersión del material vegetal en  
con las raíces de la mayoría de las plantas (Smith & una solución alcalina a alta temperatura para el  
Read, 2008; Valdés et al., 2020). En esta simbiosis, vaciamiento del contenido celular, con una posterior  
el hongo recibe fotosintatos para su crecimiento acidificación y coloración con azul de tripán. Sin  
y propagación, y la planta obtiene una mejora en embargo, esta metodología no resulta adecuada  
la absorción de nutrientes (principalmente P y N) para todos los tipos de hojarasca debido a la gran  
y una mayor tolerancia frente a distintos tipos de diversidad anatómica y bioquímica que posee  
estrés biótico y abiótico (Smith & Read, 2008).  
este material. En el presente trabajo se evaluaron  
Los HMA no sólo se desarrollan en el suelo y y ajustaron tres técnicas de clarificación, con su  
en las raíces de las plantas hospedantes, sino que posterior tinción, en hojarasca de ocho especies  
también, se ha detectado micelio y esporas extra- arbóreas, con el objetivo de determinar el método  
radicales en hojarasca de diversos ecosistemas más apropiado que logre un adecuado vaciamiento  
naturales y agrícolas (Bunn et al., 2019; Díaz de las células y conservación de los tejidos foliares,  
Ariza et al., 2021). Su función en la hojarasca y de esta manera, poder detectar estructuras extra-  
aún no ha sido esclarecida (Bunn et al., 2019), radicales de los HMA desarrolladas en los distintos  
ya que son incapaces de descomponer materia tipos de hojarasca.  
orgánica (MO) por carecer de enzimas líticas  
(Tisserant et al., 2011; Kobayashi et al., 2018). Sin  
embargo, los HMA cumplen una función indirecta materialeS y métodoS  
en la descomposición de la MO tras favorecer la  
promoción del crecimiento de microorganismos Material biológico  
descomponedores asociados a sus hifas (Churchland  
Grayston, 2014; Linlin et al., 2019; Mei et al., parque de Ciudad Universitaria de la Facultad de  
022). En los últimos años ha crecido el interés por Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad  
En el otoño e invierno del año 2020 en el  
&
2
el estudio de los HMA presentes en la hojarasca de Buenos Aires (Ciudad Autónoma de Buenos  
de distintas especies vegetales y en diversos Aires, Argentina), se recolectó hojarasca ubicada  
ambientes, con el fin de comprender su rol en los sobre la superficie y en contacto directo con  
ciclos biogeoquímicos de nutrientes, en particular, el suelo, y cercana al tronco de las siguientes  
en el subciclo del carbono del suelo y su efecto especies de árboles: Tipuana tipu (Benth.) Kuntze,  
sobre el cambio climático (Gougoulias et al., 2014). Fraxinus pennsylvanica Marshall., Ulmus minor  
En el campo de la histología vegetal existen Mill., Platanus acerifolia (Aiton) Willd., Laurus  
varios métodos de clarificación de hojas con un nobilis L., Populus alba L., Melia azedarach L.  
mismo objetivo: la eliminación del contenido y Quercus robur L. Por otro lado, se recolectó  
celular y la facilitación de la observación de los únicamente hojarasca de F. pennsylvanica en el  
tejidos. Estos métodos de clarificación, seguidos Parque Tres de Febrero (Bosques de Palermo,  
de tinción, han permitido el estudio de la epidermis Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina)  
foliar, el tejido parenquimático, la presencia de para su inoculación con el hongo Rhizoglomus  
estructuras de secreción, y la disposición de los intraradices (N.C. Schenck & G.S. Sm.) Sieverd.,  
haces vasculares de las hojas (Peterson et al., 2008; G.A. Silva & Oehl asociado a Medicago sativa L.  
Arambarri, 2018). La selección del método de (alfalfa) creciendo en condiciones controladas de  
clarificación suele depender de la pigmentación, invernadero. Esto nos permitió obtener hojarasca  
del grosor de la hoja y de las estructuras a preservar con estructuras extra-radicales del HMA que fue  
(Peterson et al., 2008). utilizada en la evaluación de las distintas técnicas.  
Una de las técnicas más utilizadas para la Toda la hojarasca recolectada se secó a temperatura  
detección de endófitos fúngicos en raíces y la ambiente (aprox. 25 °C) por 5 días, y se conservó en  
observación de las estructuras extra-radicales de condiciones de oscuridad hasta su procesamiento.  
178  
S. Crescio et al. - Técnicas de clarificación y detección de hongos micorrícicos arbusculares en hojarasca  
Para la inoculación de la hojarasca de de ácido clorhídrico (HCl 0,1 N; v/v) por 20 min a  
F. pennsylvanica, se sembró una semilla temperatura ambiente (aprox. 25 °C). Por último, se  
germinada de M. sativa en una maceta (12 realizó un lavado con agua destilada, y se sumergió  
cm de diámetro) conteniendo sustrato estéril en una solución de Azul de Tripán en ácido láctico  
(perlita:vermiculita:suelo tindalizado, v/v/v, 2:1:1), 0,05% (p/v) por 16 a 20 hs a temperatura ambiente  
la cual fue inoculada con 5 g de inóculo general de (aprox. 25 °C) (Fig.1A). El exceso de colorante se  
la especie R. intraradices cepa GA5 (provista por eliminó mediante varios lavados con agua destilada,  
el Banco de Glomeromycota in vitro, BGIV, https:// y se conservó el material teñido en agua destilada a  
bgiv.com.ar/, FCEN, UBA). Luego de 40 días, en 25 °C en oscuridad hasta su observación bajo lupa  
cada maceta se colocaron tres bolsitas de malla binocular (Fig. 1A).  
2
plástica de 6 cm y de 1 mm de porosidad, lo que  
permitió el paso del micelio y la exclusión de las Técnica 5-5-5 de Arambarri (2018)  
raíces. Cada bolsita conteniendo 0,5 g de hojarasca  
Se fijó el material en una solución de etanol 50%  
de F. pennsylvanica (equivalente a 2-3 hojas) fue (v/v) durante 7 días en oscuridad, y luego se lavó  
ubicada dentro del sustrato, distanciadas entre sí con agua destilada. Posteriormente, la hojarasca  
y a aproximadamente 5 cm del tallo de la planta. fue sumergida en una solución de hidróxido de  
Se realizaron cuatro cultivos que se mantuvieron sodio e hipoclorito de sodio (NaOH 5%:NaClO  
durante 4 meses en condiciones de invernadero bajo 5%; 1:1; v/v) durante 90 min para su clarificación,  
luz natural, humedad y temperatura semicontrolada. controlando cada 15 min que no se degraden los  
Transcurrido ese período, se recogieron las bolsitas, tejidos (Fig. 1B). En aquellos casos que no se  
se eliminaron las partículas del sustrato adheridas alcanzó la clarificación, se dejó la hojarasca en la  
a ella con la ayuda de un pincel, y se separó la misma solución controlando diariamente. Se lavó  
hojarasca, la cual fue secada al aire a temperatura en agua destilada, y aquella hojarasca que requirió  
ambiente (aprox. 25 °C) para ser posteriormente blanqueamiento fue colocada en una solución de  
clarificada y teñida.  
hipoclorito de sodio (NaClO 50%, v/v) durante  
0 a 15 min para completar su decoloración. Por  
último, se sumergió en una solución de hidrato de  
1
Procesamiento de la hojarasca  
Cada hojarasca se colocó en placas de Petri de cloral (5%, p/v) por 1 h en oscuridad, y se lavó con  
vidrio (9 cm de diámetro), evitando su superposición agua destilada. La tinción se realizó con la solución  
y asegurando el contacto directo con las soluciones. de Azul de Tripán (0,05% p/v) durante 48 hs, y se  
De acuerdo con el tamaño, se colocaron dos a tres lavó con agua destilada para eliminar el exceso  
hojas por placa de Petri de T. tipu, U. minor, M. de colorante. Todos los pasos de esta técnica se  
azedarach y F. pennsylvanica, mientras que para realizaron a temperatura ambiente (aprox. 25 °C).  
P. acerifolia, P. alba, L. nobilis y Q. robur solo El material teñido fue conservado en agua destilada  
se colocó una hoja por caja de Petri. Por técnica a 25°C en oscuridad hasta su observación bajo lupa  
y especie vegetal se realizaron tres réplicas, y binocular (Fig. 1B).  
en todos los casos se eligieron hojas enteras que  
presentaban un estado de descomposición similar.  
Técnica de Peterson et al. (2008)  
La hojarasca se fijó con una solución de Carnoy  
Técnica modificada de Phillips & Hayman (1970) modificada (ácido acético glacial:etanol 95%, 1:3,  
para hojarasca v/v) a temperatura ambiente durante 5 días. Luego,  
Cada hojarasca se sumergió en una solución el material vegetal se separó en dos grupos, los  
de hidróxido de potasio (KOH 10%, p/v) durante cuales recibieron un tratamiento de clarificación  
4
8 a 72 hs a temperatura ambiente (aprox. 25 °C) alcalina o ácida para evaluar la respuesta de los  
ó a 90 °C (sin llegar a ebullición) por 30 a 90 tejidos. En el tratamiento ácido, cada hojarasca  
min. El estado del material fue controlado cada se sumergió en una solución de ácido láctico  
1
5 min en el tratamiento con calor, y cada 24 hs 85% (v/v) durante 6 días a temperatura ambiente  
en el de temperatura ambiente. Luego, las hojas ó a 90 °C por 30 a 40 min; y en el tratamiento  
fueron lavadas tres veces con agua destilada, y se alcalino, se utilizó una solución de NaOH 5% (p/v)  
transfirieron a otra caja de Petri con una solución durante 24 hs a temperatura ambiente (Fig. 1C).  
179  
Bol. Soc. Argent. Bot. 58 (2) 2023  
Fig. 1. Técnicas de clarificación y tinción. A: Método de clarificación modificado de Phillips & Hayman (1970).  
B: Método modificado “5-5-5” de Arambarri (2018). C: Método de Peterson et al. (2008). Abreviatura= T  
amb: temperatura ambiente.  
A la hojarasca tratada con NaOH 5% (p/v) que oscuros. Para la observación de estructuras  
formó precipitados de compuestos fenólicos, se le fúngicas, la hojarasca se tiñó con la solución de  
realizó un tratamiento post-álcali (Gardner, 1975), Azul de Tripán (0,05% p/v) a temperatura ambiente  
lavándola sucesivamente en agua destilada a 90 °C, por 48 hs, y luego se lavó con agua destilada. La  
etanol 70% (v/v) a 70 °C, y por último, en etanol hojarasca teñida se conservó en agua destilada a 25  
9
6% (v/v) a 72 °C, entre 5 a 10 min por lavado, °C y en oscuridad hasta su observación bajo lupa  
hasta observar la desaparición de los precipitados binocular (Fig. 1C).  
180  
S. Crescio et al. - Técnicas de clarificación y detección de hongos micorrícicos arbusculares en hojarasca  
Estimación de la frecuencia e intensidad de HMA  
Para estimar la frecuencia e intensidad de la  
presencia de HMA en la hojarasca recolectada y en  
la de F. pennsylvanica expuesta a R. intraradices, se  
utilizó la técnica de Plenchette & Morel (1996) que  
fue adaptada para este material. En un portaobjetos  
se montaron 30 segmentos de hoja de 5 mm  
seleccionados al azar y en grupos de a 10, los cuales  
se examinaron bajo microscopio a un aumento de  
que bajo esta metodología no logró eliminarse. Para  
lograr una clarificación completa y la conservación  
de los tejidos en la hojarasca de P. alba, L. nobilis  
(Fig. 2A), Q. robur (Fig. 2B), P. acerifolia y U.  
minor fue necesario dejarlas en KOH 10% por  
72 hs a temperatura ambiente. Por el contrario,  
el tratamiento con calor aceleró el proceso de  
clarificación aunque se observó degradación de  
la hojarasca, variando el efecto según la especie.  
En particular, la hojarasca de L. nobilis mantuvo  
mejor su estado de conservación, y en P. acerifolia  
se observó un oscurecimiento del tejido, que  
luego de 30 min comenzó a clarificarse, siendo  
necesario dejarla por 90 min más para completar  
el proceso. La hojarasca de P. acerifolia, Q. robur,  
L. nobilis y U. minor requirió un recambio de la  
solución alcalina pasados los primeros 30 min  
de calentamiento debido al oscurecimiento de la  
solución.  
2
200X. La frecuencia (% F) de presencia de estructuras  
de HMA se calculó como el porcentaje de segmentos  
que contenían hifas y esporas extra-radicales de HMA  
respecto al total. La intensidad de la presencia de HMA  
(% I) fue calculada como la abundancia de estructuras  
extra-radicales de HMA en cada segmento usando  
distintas clases de intensidad (v: 1-20%; w: 21-40%;  
x: 41-60%; y: 61-80%; z: 81-100%), y el resultado  
expresado utilizando la siguiente fórmula matemática:  
%I= (10v + 30w +50x + 70y + 90z)/ (v + w + x + y +  
z), donde v, w, x, y, z son el número de segmentos de Etapa previa a la tinción: La acidificación del material  
hojarasca de cada clase.  
durante 20 min a temperatura ambiente no alteró la  
estructura original de las hojarascas evaluadas (Fig.  
2B), y fue necesaria para el proceso de tinción.  
reSultadoS  
Técnica modificada “5-5-5” de Arambarri (2018)  
Técnica modificada de Phillips & Hayman (1970) Fijación: La fijación del tejido en etanol 50% durante  
para hojarasca  
Fijación: La técnica propone fijar el tejido con una  
7 días mejoró la preservación del material y la  
extracción de los componentes solubles.  
solución de FAA (200 ml 50% etanol, 5 ml de Clarificación: La duración del tratamiento con NaOH  
ácido acético y 13 ml formaldehído), pero esto no  
se realizó dado que la hojarasca fijada se desintegró  
durante el proceso de clarificación.  
5%:NaClO 5% fue variable dependiendo del tipo  
de hojarasca. La hojarasca de T. tipu comenzó  
a clarificarse luego de 60 min, mientras que la  
de M. azedarach lo hizo después 90 min. Este  
procedimiento fue muy agresivo para la hojarasca  
de F. pennsylvanica (Fig. 2C), la cual se fragmentó  
y perdió su integridad tras 7 días de tratamiento. En  
cambio, para la hojarasca de U. minor, P. acerifolia,  
P. alba, Q. robur y L. nobilis la clarificación duró 7  
días en la misma solución (Fig. 2D-F).  
Clarificación: La duración del tratamiento y la  
temperatura de inmersión en álcali (KOH 10%)  
fueronlasdosvariablescontroladasparaconservarla  
estructura del material. El calentamiento propuesto  
por Phillips & Hayman (1970) aceleró el proceso  
pero deterioró todos los tipos de hojarasca, mientras  
que a temperatura ambiente se obtuvo una mejor  
clarificación en todas las muestras. Sin embargo, Blanqueamiento: La hojarasca de Q. robur y P.  
las características de la hoja de cada especie fueron  
determinantes en la duración del tratamiento. En las  
hojas de T. tipu, M. azedarach y F. pennsylvanica  
se logró el vaciamiento del contenido celular tras  
ser expuesta a KOH 10% por 72 hs a temperatura  
ambiente, aunque el tejido quedó debilitado y  
quebradizo. La hojarasca de T. tipu, a diferencia  
de F. pennsylvanica y M. azedarach, comenzó a  
acerifolia no se decoloró completamente, por lo  
que requirió un blanqueamiento con NaClO 50%  
durante 10 a 15 min. Luego del lavado con agua  
destilada e inmersión en hidrato de cloral 5%  
durante 1 h se clarificaron por completo, aunque  
se observó ablandamiento y fragmentación de los  
tejidos bajo este procedimiento.  
clarificarse a los 5 minutos, sin embargo, se observó Técnica de Peterson et al. (2008)  
un oscurecimiento alrededor de la nervadura media Fijación: No se observó degradación del material tras  
181  
Bol. Soc. Argent. Bot. 58 (2) 2023  
Fig. 2. Fragmentos de hojarasca tratada bajo los distintos métodos de clarificación. A-B según Phillips &  
Hayman (1970). A: Detalle de Laurus nobilis clarificado. B: Detalle de Quercus robur clarificado y teñido.  
C-F según Arambarri (2018). C: Detalle de Fraxinus pennsylvanica clarificado. D: Ulmus minor clarificado.  
E: Detalle de Platanus acerifolia luego de clarificación. F: Detalle de Populus alba. G-H-I: según Peterson  
et al. (2008). G: Detalle de Tipuana tipu bajo tratamiento ácido y teñida con azul de tripán 0,05%. H: Detalle  
de T. tipu tratada con NaOH 5% y teñida con azul de tripán 0,05%. I: Aspecto general de hojarasca de F.  
pennsylvanica bajo clarificación alcalina y teñida. Escalas= A-I: 0,5 mm.  
la fijación con la solución de Carnoy durante 5 días  
a temperatura ambiente (25 °C).  
Clarificación: En ambos tratamientos ensayados  
el tratamiento con calor (90 °C) resultó ser muy  
agresivo para los tejidos. En cambio, la clarificación  
alcalina a temperatura ambiente resultó ser la más  
adecuada para este tipo de material, dado que se  
pudo eliminar todos los precipitados fenólicos  
oscuros (Fig. 2H-I). Para la hojarasca de Q. robur,  
U. minor, P. acerifolia, L. nobilis y P. alba, ambos  
métodos de clarificación (ácida y alcalina) fueron  
óptimos a temperatura ambiente y no se observaron  
(alcalino y ácido), todos los tipos de hojarasca se  
clarificaron al ajustar el tiempo y la temperatura de  
exposición a los reactivos. Para la hojarasca de F.  
pennsylvanica, T. tipu (Fig. 2G) y M. azedarach,  
se logró la clarificación en medio ácido después  
de 24 hs a temperatura ambiente, mientras que  
182  
S. Crescio et al. - Técnicas de clarificación y detección de hongos micorrícicos arbusculares en hojarasca  
alteraciones de los tejidos. La duración de la  
clarificación ácida pudo reducirse a 40 min cuando  
se sometió a 90 °C.  
especies (Fig. 2 H-I). En cambio, el tratamiento con  
ácido láctico evitó la formación de los precipitados  
fenólicos, pero resultó ser más agresivo para la  
hojarasca.  
Etapa previa a la tinción: La solución de NaOH  
5
% formó precipitados fenólicos oscuros en la  
hojarasca de F. pennsylvanica y T. tipu, por lo Tinción y visualización de estructuras de HMA  
que fue necesario su eliminación con sucesivos En las tres metodologías ensayadas se usó el  
lavados con agua destilada (90 °C), etanol 70% colorante azul de tripán 0,05%, el cual coloreó  
70 °C) y etanol 96% (72 °C). Este procedimiento eficazmente las paredes celulares del tejido foliar y las  
(
no perjudicó al tejido de la hojarasca de dichas estructuras fúngicas halladas en la hojarasca (Fig. 3).  
Fig. 3. Detección de estructuras fúngicas en la hojarasca. A: Hifas extra-radicales de HMA sobre hojarasca  
recolectada de Tipuana tipu, previamente clarificada con el método modificado de Phillips & Hayman  
(1970) y teñida con azul de tripán 0,05%. B: Hifas y esporas extra-radicales de Rhizoglomus intraradices  
desarrolladas en hojarasca de Fraxinus pennsylvanica previamente clarificada con el método de Peterson et  
al. (2008) y teñida con azul de tripán 0,05%. C: Vista general de estructuras de hongos pertenecientes a los  
ascomycetes sobre hojarasca clarificada de T. tipu según Peterson et al., (2008). D: Detalle de estructuras  
de hongos del grupo de los ascomycetes sobre hojarasca de F. pennsylvanica previamente clarificada con  
el método de Peterson et al., (2008). Abreviaturas= h: hifas de HMA; e: esporas de HMA; a: estructura de  
hongos Ascomycota. Escalas= A-D: 0,5 mm.  
183  
Bol. Soc. Argent. Bot. 58 (2) 2023  
Las paredes hifales permanecieron intactas luego de la (2018) y Peterson et al. (2008). Estos métodos se  
clarificación y tinción bajo todos los tratamientos.  
diferenciaron en los reactivos utilizados, la duración  
Únicamente en una hoja recolectada de T. tipu y las condiciones de temperatura a las cuales fue  
se observaron hifas extra-radicales de HMA, sometido el material en cada una de las etapas.  
ocupando menos del 10 % de la superficie del tejido  
La técnica de Phillips & Hayman (1970) no  
(Fig. 3A), mientras que el 22,5 ± 16,9 % (media ± resultó apropiada para aquella hojarasca de pocas  
desvío estándar) de la hojarasca de F. pennsylvanica capas de células, como la de T. tipu, M. azedarach  
inoculada con R. intraradices, presentaba micelio y y F. pennsylvanica, ya que se degradó su estructura,  
esporas formadas a partir de ramificaciones hifales principalmente cuando eran expuestas a altas  
(Fig. 3B), con una intensidad de colonización del temperaturas. En cambio, para la hojarasca de P.  
3
0,3 ± 16,8 %. Por otro lado, en las hojarascas de alba, P. acerifolia, U. minor, Q. robur y L. nobilis  
T. tipu (Fig. 3C), F. pennsylvanica (Fig. 3D), P. se logró una buena clarificación a temperatura  
acerifolia, P. alba, U. minor, Q. robur, L. nobilis, ambiente tras un mayor tiempo de exposición frente  
y M. azedarach se detectaron numerosas hifas a los reactivos. Este tratamiento se redujo en calor  
delgadas y tabicadas, y otras estructuras de hongos aunque se observó una mayor degradación de los  
saprobios y/o fitopatógenos pertenecientes al grupo tejidos. Al aplicar la técnica “5-5-5” (Arambarri,  
de los ascomycetes. Los HMA en la hojarasca se 2018), la hojarasca de F. pennsylvanica, T. tipu y  
diferenciaron del resto de los hongos por sus hifas M. azedarach perdió su integridad al completar el  
cenocíticas de mayor grosor, la arquitectura del proceso. Mientras que la hojarasca de Q. robur,  
micelio y el patrón de esporulación, en el caso de L. nobilis, P. acerifolia y P. alba quedó bien  
la hojarasca de F. pennsylvanica en contacto con R. clarificada, aunque el proceso de blanqueamiento  
intraradices (Fig. 2I; 3A-B).  
comprometió gran parte de su estructura. Gardner  
En cuanto a la conservación del material, la (1975) menciona que el tratamiento con hidrato de  
hojarasca clarificada y teñida bajo el método de cloral o con blanqueadores fuertes, como NaClO  
Peterson et al. (2008) pudo mantenerse en agua ó peróxido de hidrógeno, puede afectar al tejido  
destilada hasta por lo menos 16 semanas bajo ya que actúa sobre los componentes de celulosa y  
condiciones de oscuridad y temperatura ambiente, lignina. Por otra parte, la metodología de Peterson  
sin observar modificaciones en su estructura y et al. (2008) fue la más conveniente para todos los  
manteniendo la coloración.  
tipos de hojarasca ensayadas, dado que permitió la  
clarificación completa del tejido. Sin embargo, la  
clarificación ácida y en calor resultó ser más agresiva  
que el tratamiento alcalino, por lo que se requiere de  
un mayor control sobre el tiempo de exposición. Por  
diScuSión  
Los estudios que analizan la presencia de HMA otro lado, el tratamiento alcalino conservó mejor  
en hojarasca han utilizado el método de clarificación la estructura vegetal, aunque en algunos casos se  
y tinción de Phillips & Hayman (1970), propuesto produjeron precipitados fenólicos oscuros que sólo  
para la detección de estructuras de HMA en raíces pudieron eliminarse con un tratamiento de lavado  
de plantas hospedantes (Aristizábal et al., 2004; post-álcali. En cuanto a la fijación del material,  
Bunn et al., 2019; Díaz Ariza et al., 2021). Sin Gardner (1975) sugiere que la solución de etanol  
embargo, este método puede no ser adecuado o Carnoy aceleran la clarificación, mientras que la  
para todos los tipos de hojarasca dada la gran fijación con FAA(propuesta por Phillips & Hayman,  
diversidad anatómica y bioquímica, y el estado de 1970) es perjudicial para el proceso, ya que la  
descomposición en que se hallan. Por lo que resulta hojarasca en FAA resiste el tratamiento con KOH  
necesario estudiar otras técnicas que logren una y daña la celulosa. Además, el formaldehído puede  
buena clarificación y conservación del material, con reaccionar con compuestos fenólicos de la hojarasca  
el fin de poder visualizar estructuras fúngicas en toda (como los taninos condensados), y formar polímeros  
el área de la hojarasca bajo estudio. En el presente oscuros que sólo pueden ser eliminados a través del  
trabajo, se evaluaron tres técnicas de clarificación y blanqueamiento (aunque este proceso puede ser  
tinción sobre hojarasca de ocho especies arbóreas: perjudicial para la integridad del tejido en algunas  
Phillips & Hayman (1970), “5-5-5” de Arambarri especies) (Gardner, 1975).  
184  
S. Crescio et al. - Técnicas de clarificación y detección de hongos micorrícicos arbusculares en hojarasca  
Nuestros resultados revelan que la anatomía y  
En conclusión, la metodología propuesta  
bioquímica foliar de cada especie arbórea son factores por Peterson et al. (2008) permitió una buena  
determinantes a tener en cuenta al seleccionar la clarificación y conservación de las hojarascas  
técnica de clarificación. La mayoría de las hojas evaluadas, y la observación de estructuras  
poseen una capa simple de células epidérmicas en su fúngicas. Sin embargo, es necesario adaptar la  
superficie adaxial y abaxial, pero las características técnica según las características de la hojarasca  
de la cutícula ó el contenido de fenoles y pigmentos en estudio teniendo en cuenta el número de capas  
pueden variar e influir sobre la efectividad de cada de células, contenido de pigmentos, taninos y  
método (Peterson et al., 2008).  
otros componentes de difícil remoción, así como  
En cuanto a la presencia de HMA en la hojarasca también, su estado de descomposición.  
recolectada de los parques urbanos, sólo se  
encontraron hifas de HMA en un ejemplar de  
hojarasca de T. tipu. La falta de estructuras de HMA contribución de loS autoreS  
en la hojarasca de estos ambientes urbanos podría  
deberse a la ausencia o baja densidad del micelio  
SC y VS diseñaron y realizaron la investigación.  
extra-radicaldeHMAcercanoalasuperficiedelsuelo, Todas las autoras han participado conjuntamente  
o por algún disturbio que evitó la colonización de la en la interpretación de los datos y redacción del  
hojarasca por estos hongos, y no a causa del proceso manuscrito.  
de clarificación y tinción, ya que se observaron  
estructuras de otros grupos de hongos. En ambientes  
naturales (no urbanizados) y agroecosistemas que se agradecimientoS  
han analizado hasta el momento, la colonización de  
la hojarasca por HMA suele ser más frecuente (Bunn  
Este trabajo fue financiado por UBACYT  
et al., 2019; Díaz Ariza et al., 2021). El análisis del 20020170100142BA y el programa de Becas de  
estado micorrícico de la vegetación y el estudio Estímulo a las Vocaciones Científicas. Además,  
de las comunidades de HMA en estos parques se agradece el aporte valioso de los revisores y la  
podría brindar más información sobre la frecuencia editora a cargo del boletín de la SAB.  
e intensidad de colonización de la hojarasca. En  
cuanto a la hojarasca de F. pennsylvanica expuesta  
al micelio extra-radical de R. intraradices bajo bibliografía  
condiciones controladas, alcanzó valores similares  
a los hallados en hojarasca colonizada por HMA ARAMBARRI, A. M. 2018. La “técnica de clarificación  
de Myrica parvifolia Benth. (aprox. 37%) y Coffea  
arabica L. (aprox. 36%) (Aristizábal et al., 2008;  
Díaz Ariza et al., 2021). Las variaciones en la  
5-5-5”, un método natural para el tratamiento de  
material vegetal. Bol. Soc. Argent. Bot. 53: 579-586.  
http://dx.doi.org/10.31055/1851.2372.v53.n4.21980.  
frecuencia e intensidad de colonización podrían ARISTIZABAL, C., E. L. RIVERA& D. P. JANOS. 2004.  
ser atribuidas al tipo de hojarasca y su estado de  
descomposición, y a las especies de HMA que se  
encuentran en cada ecosistema (Bunn et al., 2019;  
Chowdhury et al., 2022), siendo necesario más  
Arbuscular mycorrhizal fungi colonize decomposing  
leaves of Myrica parvifolia, M. pubescens and  
Paepalanthus sp. Mycorrhiza 14: 221-228.  
https://doi.org/10.1007/s00572-003-0259-0  
estudios que analicen posibles preferencias de los BUNN, R. A., D. T. SIMPSON & L. S. BULLINGTON.  
HMA por el sustrato y su relación con el proceso  
de descomposición. A su vez, las técnicas evaluadas  
permitieron detectar eficientemente estructuras de  
otros hongos pertenecientes a los ascomycetes sobre  
la epidermis y el parénquima de la hojarasca de  
todas las especies arbóreas. Su abundante presencia  
resultó esperable dado que estos microorganismos  
son fitopatógenos y/o saprobios descomponedores  
del material vegetal (Cao et al., 2022).  
2019. Revisiting the ‘direct mineral cycling’  
hypothesis: arbuscular mycorrhizal fungi colonize  
leaf litter, but why? ISME J. 13: 1891-1898.  
https://doi.org/10.1038/s41396-019-0403-2  
CAO, T., Y. CHENG, Y. FANG, X. KONG, J. YANG,  
H. ALHARBI, Y. KUZYAKOV & X. TIAN. 2022.  
Synergy of saprotrophs with mycorrhiza for litter  
decomposition and hotspot formation depends on  
nutrient availability in the rhizosphere. Geoderma  
185  
Bol. Soc. Argent. Bot. 58 (2) 2023  
4
10:115662.  
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