Araceli Belén Minetti1, Solange Duchein2, Hector Andrés Suarez3, Susana Rivolta4, Isabel Inés González5
1-Bioquimica en Laboratorio del Hospital de NIños de la Santísima Trinidad, Córdoba, Argentina. Correo de contacto: ara_minetti@hotmail.com
2-Bioquímica en Laboratorio de Fundación Lenox, Córdoba, Argentina.
3-Bioquimico, especialista en Toxicología en Laboratorio del Hospital de Niños de la Santísima Trinidad, Córdoba, Argentina. Universidad Nacional de Córdoba, Facultad de Ciencias Químicas, Departamento de Farmacología, Córdoba, Argentina.
4-Magíster, Especialista, Bioquímica en la Universidad Nacional de Córdoba, Facultad de Ciencias Médicas, Escuela de Salud Pública. Córdoba, Argentina.
5- Bioquímica Especialista en Toxicología en Laboratorio del Hospital de Niños de la Santísima Trinidad, Córdoba, Argentina. Universidad Nacional de Córdoba, Facultad de Ciencias Químicas, Departamento de Farmacología, Córdoba, Argentina.
La difenihidantoina (DFH) es un fármaco utilizado para el tratamiento de distintos tipos de convulsiones. Al ser una droga de estrecho índice terapéutico, es decir, que pequeñas variaciones en las dosis pueden generar grandes variaciones en las concentraciones sanguíneas y, en consecuencia, esto puede llevar a una falta de eficacia y/o toxicidad. Los niveles sanguineos deben controlarse, y esto se lleva a cabo a traves de metodos inmunologicos preparados para esa matriz, entre otros. También se pueden monitorizar los niveles de DFH en otros fluidos como saliva. Para ello debemos poner a punto dichos métodos para la matriz saliva. En este trabajo se realiza la puesta a punto de un método para la cuantificación de DFH, en saliva.
Existen muchos trabajos en los que se ha encontrado una coincidencia entre la concentración de fenitoína en saliva y la concentración de fenitoína libre en suero o plasma. Muchos investigadores realizaron la validación de métodos para el dosaje de fenitoína en saliva.
El aporte de este trabajo radica en la validación de una metodología útil para el monitoreo de fenitoína en saliva, una matriz con numerosas ventajas, principalmente para el seguimiento y control de aquellos pacientes pediátricos y de difícil acceso venoso que se encuentran en tratamiento crónico con dicho anticonvulsivo
La Fenitoína (DFH), es un anticonvulsivante ampliamente utilizado para el tratamiento de distintos tipos de convulsiones. (1) El monitoreo terapéutico (TDM) es requerido para la DFH debido a su estrecho rango terapéutico y farmacocinética no lineal, entre otras características. Los monitoreos se realizan frecuentemente en plasma o suero (droga total) a través de métodos inmunológicos. También se puede monitorear DFH en saliva, la cual presenta una buena correlación con el plasma. La concentración de DFH en saliva refleja la concentración de droga libre y debido a la simplicidad en su recolección, conlleva a un proceso menos estresante para el paciente. El objetivo del trabajo fue validar el método inmunológico de interacción cinética de micropartículas en solución (KIMS) para la determinación de DFH usando como matriz biológica saliva. Se analizó linealidad, precisión, límite de detección y cuantificación, exactitud e interferencia. Se utilizó el software Infostat 8.0 versión estudiantil para el análisis estadístico. El método fue lineal en un intervalo entre 0,41 y 5ug/ml. Los límites de detección y cuantificación fueron 0,14 y 0,45ug/ml respectivamente. La ecuación de la recta obtenida en base a la comparación de métodos entre KIMS y HPLC-UV fue DFHKIMS= 0,81* DFHHPLC – 0,03.
El método KIMS demostró tener las características analíticas suficientes paran ser aplicado como herramienta útil y práctica para el seguimiento de aquellos pacientes de difícil acceso venoso y/o niños con tratamientos crónicos con DFH.
Palabras claves: fenitoína; saliva; inmunoensayo; monitoreo terapéutico
Abstract
Phenytoin (DFH), is an anticonvulsant widely used for the treatment of different types of seizures. (1) Therapeutic monitoring (TDM) is required for DFH due to its narrow therapeutic range and nonlinear pharmacokinetics, among other characteristics. Monitoring is frequently done on plasma or serum (total drug) through immunological methods. DFH can also be monitored in saliva, which shows a good correlation with plasma. The concentration of DFH in saliva reflects the concentration of free drug and due to the simplicity in its collection, it leads to a less stressful process for the patient. The aim of this study was to validate the immunological method of kinetic interaction of microparticles in solution (KIMS) for the determination of DFH using saliva as biological matrix. Linearity, precision, detection and quantification limit, accuracy and interference were analyzed. Infostat 8.0 student version software was used for statistical analysis. The method was linear in a range between 0.41 and 5ug/ml. The detection and quantification limits were 0.14 and 0.45ug/ml, respectively. The equation of the straight line obtained based on the method comparison between KIMS and HPLC-UV was DFHKIMS= 0,81* DFHHPLC – 0,03.
The KIMS method proved to have the necessary analytical characteristics to be applied as a useful and practical tool for the follow-up of those patients with difficult venous access and/or children with chronic DFH treatments.
Keywords: phenhytoin; saliva; immunoassay; therapeutic monitoring.
A fenitoína (DFH) é um anticonvulsivante amplamente utilizado para o tratamento de diversos tipos de convulsões. O monitoramento terapêutico (TDM) é necessário para DFH devido à sua estreita faixa terapêutica e farmacocinética não linear, entre outras características. A monitorização é frequentemente feita em plasma ou soro (droga total) através de métodos imunológicos. A DFH também pode ser monitorada na saliva, o que mostra uma boa correlação com o plasma. A concentração de DFH na saliva reflete a concentração do fármaco livre e devido à simplicidade em sua coleta, leva a um processo menos estressante para o paciente. O objetivo do trabalho foi validar o método imunológico de interação cinética de micropartículas em solução (KIMS) para a determinação de DFH utilizando saliva como matriz biológica. Foram analisadas linearidade, precisão, limite de detecção e quantificação, exatidão e interferência. O software Infostat 8.0 versão estudante foi utilizado para análise estatística. O método foi linear em uma faixa entre 0,41 e 5 ug/ml. Os limites de detecção e quantificação foram 0,14 e 0,45ug/ml, respectivamente. A equação da reta obtida com base na comparação de métodos entre KIMS e HPLC-UV foi DFHKIMS= 0,81* DFHHPLC – 0,03.
O método KIMS mostrou ter as características analíticas necessárias para ser aplicado como uma ferramenta útil e prática para o acompanhamento de pacientes com acesso venoso difícil e/ou crianças em tratamento crônico de DFH.
Palavras chaves: fenitoina; saliva; inmunoensayo; monitoreo.
La Fenitoína (DFH), es un anticonvulsivante eficaz en las convulsiones parciales y tonicoclónicas, además de ser utilizado para el tratamiento en convulsiones que ocurren durante o luego de neurocirugías o traumatismos de cráneo severos. Su actividad anticonvulsiva la ejerce debido a que limita la activación repetitiva de los posibles de acción evocados por la despolarización sostenida de las neuronas de la médula espinal. Este efecto es mediado por retraso en la velocidad de recuperación de los canales de sodio activados por voltaje a partir de la inactivación. (1,2)
La absorción de la DFH luego de una dosis oral es variable y depende de la formulación, con un tiempo máximo (T máx) de 1-12 horas. La biodisponibilidad, también depende de la formulación, y es mayor al 80%. (1)
Su farmacocinética no es lineal, tipo Michaelis-Menten. Debido al metabolismo enzimático saturable, pequeñas variaciones de dosis resultan en grandes cambios en la concentración sérica de la droga. La unión a proteínas de la fenitoína es del 90% y se metaboliza en el hígado, principalmente por las CYP2C9 y CYP2C19, para formar dos metabolitos principales, que no presentan actividad farmacológica, denominados 5-(p-hidroxifenil)-5 fenilhidantoína y un derivado dihidrodiol. Debido a que estas enzimas son encargadas de metabolizar otros fármacos, es posible que se produzcan interacciones farmacológicas. Además, las enzimas del CYP450 son fácilmente inhibidas o inducidas por gran variedad de drogas, incluso la misma fenitoína. La vida media de eliminación en adultos es de 30-100 horas ya que su depuración interindividual es muy variable. (1,2,3,4,5)
El monitoreo de drogas terapéuticas (TDM) es habitual para la DFH que tiene un estrecho rango terapéutico y farmacocinética no lineal, entre otras características. Los dosajes se realizan en plasma o frecuentemente, donde se mide la cantidad de suero de droga total, es decir la droga libre más la unida a proteínas. El rango terapéutico de DFH en suero es de 10-20 ug/mL, mientras que el rango para la fracción libre es de 1-2 ug/mL (3,6,7) El dosaje de DFH puede realizarse en otras matrices biológicas como saliva, lágrima, sudor, LCR, entre otros. (1,4) La matriz saliva tiene numerosas ventajas sobre el uso de suero o plasma para el TDM, ya que refleja la concentración de droga libre en suero, la recolección es más simple, menos invasiva, menor costo, causa menos estrés, miedo y malestar, especialmente en pacientes con discapacidades, ancianos y niños, la misma puede ser recolectada, en el tiempo ideal, en el hogar y luego ser trasladada al laboratorio para la medición. (1,8)
Existen numerosos trabajos donde se ha demostrado que existen conexiones entre las concentraciones de DFH en saliva y la concentración de DFH libre en plasma o suero. Estas determinaciones se han llevado a cabo a través de métodos inmunológicos que han sido validados para la determinación de DFH en saliva, como por ejemplo inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA), enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunoensayo de reactivación de apoenzimas en fase seca ( ARIS), Radioinmunoanálisis (RIA), etc. (5,9 10,11,12)
Por todo lo expuesto anteriormente el objetivo de nuestro trabajo fue validar el método de interacción cinética de micropartículas en solución (KIMS)en la matriz saliva.
El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Toxicología del Hospital de Niños de la Santísima Trinidad.
La validación se realizó según las guías para validación de métodos analíticos del comité para productos medicinales de uso humano de la Agencia Europea de Medicamentos. (13)
Los parámetros validados fueron: linealidad, precisión, límite de detección, límite de cuantificación, exactitud, interferencia.
Para realizar este estudio se utilizó un pool de saliva libre de drogas, el cual se fortificó con una solución de Difenilhidantoína (DFH) preparada a partir de un estándar Sigma Aldrich (Argentina). El pool de saliva se recolectó a partir de voluntarios sanos que no reciben ningún tipo de medicación. La saliva se obtuvo sin estimulación, mediante una torunda de algodón, posteriormente el fluido fue extraído aplicando presión con una jeringa. Se prepararon estándares de DFH en saliva de concentraciones desde 0 a 5ug/mL, rango que incluye los niveles de decisión médica de 1 y 2 ug/mL para pacientes que requieren monitoreo de drogas terapéuticas en dicha matriz, a partir del pool mencionado anteriormente.
Las determinaciones de DFH se llevaron a cabo por el método de interacción cinética de micropartículas en solución (KIMS) en un autoanalizador COBAS 6000 de la línea Roche y los reactivos provistos fueron utilizados según las especificaciones y procedimientos recomendados por el fabricante. Este método utiliza anticuerpos (Ac) Anti-DFH que se fijan de manera covalente a micropartículas, mientras que el derivado de fármaco se une a macromoléculas. La interacción cinética de micropartículas en solución se induce al unirse el conjugado de la DFH al Ac que recubre las micropartículas y se inhibe por la DFH presente en la muestra biológica. El conjugado de DFH y la DFH presente en la muestra, compiten por fijarse al Ac anti-DFH que recubre las micropartículas. La interacción cinética de micropartículas resultante es indirectamente proporcional a la cantidad de fármaco presente en la muestra.
El método utilizado como referencia fue la cromatografía líquida de alta performance con detector ultravioleta (HPLC-UV), en un equipo de la marca Agilent, 1220 LC System; las condiciones cromatográficas utilizadas fueron: columna Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6x150mm, 5 μm; fase móvil isocrática compuesta por un buffer fosfato 0,025M y Acetonitrilo (100:10 v/v) a pH 3, con un flujo de 1 mL/min; el volumen de inyección utilizado fue 20 μL y la lectura se realizó a 205 nm.
La extracción de la DFH de la matriz saliva se realizó utilizando una columna de extracción en fase sólida Strata C-18-E (Phenomenex). El procedimiento se llevó a cabo según Kabra P. M. et al. (15) Se utilizó un estándar de DFH Sigma Aldrich y como estándar interno Carbamazepina (CBZ)(Supelco PHR1067).
Estudio de Linealidad: se realizó una curva de calibración donde se utilizaron estándares de saliva de concentración conocida: 0; 0,3; 0,63; 1,25; 2,5; 5ug/ml. Cada estándar se analizó por cuadriplicado utilizando el método KIMS. La curva de regresión lineal se obtuvo graficando la concentración de los estándares conocidos en función de la concentración de DFH obtenida por el método inmunológico.
Estudio de Precisión: se tomaron los datos del análisis por cuadriplicado de los distintos estándares de saliva preparados y se calculó el desvío estándar (DE) y el coeficiente de variación porcentual (CV%) a cada nivel de concentración.
Límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ): Los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) se obtuvieron a partir de la curva de linealidad; LOD= 3Sa/b; LOQ= 10Sa/b, donde Sa es el desvío estándar de la ordenada al origen y b la pendiente
Estudio de Interferencia: Para el estudio de interferencia se utilizaron dos estándares de DFH en saliva de concentraciones 1 y 2ug/ml a los cuales se les agregó 100ul de calibrador Preciset TDM. El calibrador Preciset TDM contiene Carbamacepina (2ug/mL), Digoxina (0,5ug/mL), Gentamicina (0,87ug/mL), Fenobarbital (6ug/mL), Primidona (2,4ug/mL), Theofilina (4ug/mL), Tobramicina (1ug/mL), Acido Valproico (15ug/mL) y Vancomicina (8ug/mL). Se analizaron los dos estándares de saliva de concentración conocida con KIMS sin agregado y con agregado de los interferentes con un n= 10. Se aplicó el test t para muestras apareadas para el análisis de los resultados.
Exactitud: se realizó una comparación de métodos en donde se procesaron estándares de DFH en saliva simultáneamente por ambos métodos, KIMS y HPLC, con los datos obtenidos se realizó una regresión lineal.
Linealidad: Del análisis de regresión se obtuvo la siguiente ecuación de la recta: y= 0,88x – 0,09; R2 = 0,99. Del análisis estadístico se obtuvo un tobs>tcrit (75,20>-0,87) lo que permite concluir que existe una correlación estadísticamente significativa lineal con un nivel de confianza del 95%. El rango de medición obtenido fue de 0,41 a 5 µg/mL.
Figura N° 1. Linealidad del método KIMS para la determinación de DFH en saliva 0,41- 5 y= 0,88x – 0,09; R2 = 0,99.
Precisión:
Los resultados del estudio de precisión se expresan en términos de desviación estándar (DE) y coeficiente de variación porcentual (CV%) y se muestran en la Tabla 1.
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Tabla Nº1: Datos del análisis de precisión. |
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DFH (ug/mL) |
X
(ug/mL) |
SD
(ug/mL) |
CV%
(ug/mL) |
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0 |
0 |
0 |
|
|
0,2 |
0,14 |
0,08 |
57,14 |
|
0,6 |
0,42 |
0,08 |
19,9 |
|
1,25 |
1,1 |
0,06 |
5,5 |
|
2,5 |
2,26 |
0,10 |
4,4 |
|
5,0 |
4,38 |
0,83 |
18,96 |
Límite de Detección y Cuantificación:
En base a los resultados donde Sa=0,04 y b=0,88, se pueden establecer LOD= 0,14 µg/mL (LOD= 3Sa/b) y; LOQ= 0,45 µg/mL (LOQ= 10Sa/b).
Interferencia:
Los resultados obtenidos, en la prueba t para muestras apareadas, demostraron que no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las muestras de estándar de DFH con y sin el agregado de los interferentes descriptos previamente tanto para el nivel de 1 como 2 µg/mL (p= 0,16 y 0,49 respectivamente). (Tabla 2)
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Tabla N°2:
Datos de análisis de interferencia. |
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Estándar DFH1ug/mL Sin Interferente. |
Estándar DFH 1ug/mL con Interferente. |
Estándar DFH 2ug/mL sin Interferente. |
Estándar de DFH 2ug/mL con Interferente. |
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1,3 |
1,0 |
1,9 |
1,9 |
|
0,9 |
1,1 |
2,0 |
1,8 |
|
0.8 |
0,9 |
1,8 |
2,1 |
|
0.9 |
0,4 |
1,8 |
1,1 |
|
1,8 |
0,2 |
1,5 |
0,9 |
|
1,5 |
0,7 |
2,0 |
0,1 |
|
1,0 |
0,8 |
2,8 |
0,8 |
|
1,3 |
2,2 |
2,6 |
1,5 |
|
1,2 |
1,3 |
2,3 |
2,4 |
|
1,2 |
1,0 |
2,5 |
2,2 |
Exactitud:
Se realizó una comparación de KIMS vs HPLC donde se obtuvo la siguiente ecuación de la recta DFHKIMS= 0,81* DFHHPLC – 0,03 con un R2=1,0. Tanto la pendiente como la ordenada al origen se encuentran dentro de los parámetros estadísticamente significativos (p= 0,656 y < 0,0001respectivamente).
Figura N2: Comparación de métodos, KIMS vs HPLC-UV. y= 0,81x – 0,03 R2= 1,0
Numerosos investigadores realizaron la validación de dosaje de DFH en saliva. En general se observa que los métodos inmunológicos cuantifican por encima del método considerado como referencia. (11,16,17,18) En nuestro caso también se obtuvo que el método KIMS cuantifica por encima de los valores obtenidos por HPLC, DFH KIMS= 0,81* DFH HPLC – 0,03 coincidiendo con lo que publicaron otros autores.
La linealidad del método fue de 0,41 a 5,0 ug/mL , esto difiere con el de otros trabajos publicados en donde los rangos en general son más amplios e incluyen concentraciones mayores, de hasta 10 ug/mL. Sin embargo, el rango obtenido por KIMS es aceptable para realizar el TDM de DFH usando como matriz saliva ya que incluye las concentraciones de DFH que corresponden a los niveles de decisión médica (1-2 ug/mL) en esta matriz. Además, concentraciones de DFH superiores a 5 ug/mL en saliva, suponen concentraciones de DFH en suero de 50ug/mL que sobrepasa el rango terapéutico en esta matriz (10-20 ug/mL) e indica una intoxicación, para lo cual la matriz saliva no sería la indicada para dosar DFH en este caso, sino el suero o plasma.
Respecto del límite de detección en el trabajo realizado por nuestro equipo de trabajo anteriormente, donde se validó el dosaje de DFH en saliva por el método inmunológico FPIA fue de 0,15ug/mL siendo el nuestro similar, 0.14ug/mL, cubriendo las mínimas concentraciones que se necesitan medir en esta matriz. (11)
Los ensayos de interferencia mostraron que no existe reacción cruzada o interferencia significativa con las drogas que habitualmente se coadministra la DFH, como se ha observado en otros trabajos.
Se realizó la validación del método KIMS para cuantificar DFH en la matriz saliva resultando un método con la sensibilidad y especificidad adecuada para el monitoreo de DFH. La validación de esta metodología ofrece una herramienta útil en laboratorio para el seguimiento y control de los pacientes en tratamientos crónicos, pediátricos y de difícil acceso venoso para la cuantificación de DFH en saliva.
1 Patsalos PN, Spencer EP, Berry DJ. Therapeutic Drug Monitoring of Antiepileptic Drugs in Epilepsy: A 2018 Update. Ther Drug Monit. 2018 Oct;40(5):526-548. doi: 10.1097/FTD.0000000000000546.
2 McNamara J O. Capítulo 21: Farmacoterapia de las epilepsias. En: Brunton, Laurence L., Bruce A. Chabner, and Björn C. Knollmann. Goodman & Gilman: Las bases farmacológicas de la terapéutica. McGraw hill, 2019. p. 501-25.
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11 Gonzalez I. I. R, Suarez H. A, Odierna E. R, Rivolta S. E, Hansen C. Fenitoína en Saliva: Cuantificación por FPIA y su aplicación en la Práctica Clínica. Ciencia Forence Latinoamericana 2016 (2) p.12-17 http://www.tiaft.org/costarica2016/data/uploads/resumen-de-ponencias.pdf
12 Paxton JW, Whiting B, Stephen KW. Phenytoin concentrations in mixed, parotid and submandibular saliva and serum measured by radioimmunoassay. Br J Clin Pharmacol. 1977 Apr;4(2):185-91. doi: 10.1111/j.1365-2125.1977.tb00692.x.
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14 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guideline- Second Edition. EP9-A2 Vol 22 Nº19 Replaces EP9-A Vol15 Nº17. 2002. Disponible en: https://webstore.ansi.org/preview-pages/CLSI/preview_EP09-A2.pdf
15 Kabra PM, Nelson MA, Marton LJ. Simultaneous very fast liquid-chromatographic analysis of ethosuximide, primidone, phenobarbital, phenytoin, and carbamazepine in serum. Clin Chem. 1983 Mar;29(3):473-6.
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19 Dolatabadi, R, Mohammadi, A, Nojaván, S., Yaripour, S., Tafakhori, A., Shirangi, M.Extracción por electromembrana, cromatografía líquida de alta resolución, detección ultravioleta de fenobarbital y fenitoína en plasma, saliva y orina humanos. Revista de la Sociedad Química China. 2021; 68(8): 1522–30.
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ninguno.
La presente investigación no contó con fuentes de financiación.
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Recibido: 2022-04-18 Aceptado: 2022-11-07
DOI: http://dx.doi.org/10.31053/1853.0605.v80.n2.37361
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