Nuevo método para obtener cultivos primarios altamente enriquecidos en poblaciones particulares de celulas de la retina de pollo. (Novel method to obtain highly enriched primary cultures of retinal horizontal cells.)

Abstract

La Melanopsina (OPN4) es un fotopigmento no visual descrito en la última década que se expresa en las células ganglionares de la retina (CGR) y que le confiere fotosensibilidad intrínseca a estas células, denominadas intrínsecamente fotosensibles (GCRif). En el pollo se encuentran presentes dos genes de OPN4, Opn4x y Opn4m, de los cuales, el producto proteico OPN4m se encuentra restringido exclusivamente a la capa de CGR, mientras que OPN4x se encuentra en las CGRs a estadios tempranos del desarrollo, pero para el día de desarrollo 15 (E15) aparece fuertemente expresada en la capa plexiforme externa, colocalizando con células Horizontales (CHs), positivas para el marcador universal de estas células, Prox-1. El objetivo de este trabajo fue lograr cultivos primarios enriquecidos en CHs a partir de la retina de pollo. Para esto se disgregaron retinas de pollos embrionarios a E15 y se sometieron las células de este disgregado a un gradiente discontinuo de albumina sérica bovina (BSA) que comprendió fases con una concentración de 1 a 4 %. Las células recuperadas de las distintas fases fueron cultivadas y caracterizadas por inmunoquímica y morfología. Los resultados muestran que la fracción correspondiente al 2,5 % de BSA contiene el mayor porcentaje de CHs, positivas para Prox-1 e Islet-1, presentando además la morfología típica de estas células retinales. Es de destacar además que con este método se logró un enriquecimiento de hasta el 80 % contra un 30 % de CHs presentes en el disgregado de partida. Con respecto a OPN4x, encontramos expresión de este fotopígmento, en células presentes en las distintas fases del gradiente (2.5, 3 y 4%). Las células de la fase 3 % presentaban procesos más largos e inmunoreactividad positiva para el neurofilamento de alto peso molecular, NF200, indicando que podrían ser CGRs. En conclusión por medio de esta metodología logramos aislar y cultivar las CHs de la retina, así como también caracterizar por diversas técnicas a estas interneuronas en cultivo.

Retinal ganglion cells (RGCs) expressing the photopigment melanopsin (Opn4) display intrinsic photosensitivity. In the chicken retina, two Opn4 genes, Opn4x and Opn4m have been described of which, Opn4m was restricted to the GC layer whereas Opn4x was limited to the forming GC layer and optic nerve at early embryonic days (E), but by E15 its expression was mostly in Prox1 (+) horizontal cells (HCs) (Verra et al., 2011). The aim of this work was to purify HCs from the chicken retina to obtain primary cultures enriched in these cells. Disaggregated chicken embryonic retinas at E15 were subjected to a discontinuous 1 to 4% bovine serum albumin (BSA) gradient [1]. Cells from the different phases were cultured and characterized by immunochemistry and morphology. The results show that only the fraction corresponding to 2.5% BSA contained most cells displaying PROX-1 and Islet-1 (+) immunoreactivities with a typical HC morphology resembling typical HCs. 30% of cells from the whole disaggregated retina and 80% from the 2.5% BSA gradient phase were Prox-1 (+). Strikingly, Opn4x-immunoreactivity was observed in cultures from both the 2.5 and 3 % BSA gradient phases. Cells from the 3% phase express the neuronal filament of 200 KDa (NF200) and display longer processes resembling RGCs. In conclusion, by means of this method we selectively separated specific retinal cell types and obtained primary cultures highly enriched in HCs expressing the non-visual opsin Opn4x.