Tratamiento combinado “in vitro” de Anfotericina-B y Clomipramina sobre promastigotes de Leishmania braziliensis

Resumo

La leishmaniasis, una enfermedad infecciosa causada por protozoarios del género Leishmania, es un problema de salud pública alrededor del mundo. Anfotericina-B, fármaco utilizado en el tratamiento, es a menudo tóxico para los pacientes. La búsqueda de nuevos fármacos debe identificar blancos moleculares en el parásito y ausentes en el huésped. La tripanotiona reductasa es una enzima exclusiva del orden Kinetoplastide, por lo que le confiere utilidad como blanco molecular. Antidepresivos tricíclicos, como clomipramina (CLO) son buenos inhibidores de esta enzima. El objetivo del presente trabajo fue analizar el tratamiento combinado “in vitro” de Anfotericina-B (ANF) y CLO sobre promastigotes de L. braziliensis.

Realizamos un ensayo de citotoxicidad (MTT) sobre celulas Vero, incubando 2,5x105 cel/mL con ANF=25-400µg/mL y CLO=25-1000µg/mL y un ensayo de efecto combinado (checkerboard) en el que se incubaron 3x106 promastigotes/mL con ANF=0,002-0,032µg/mL y CLO=0,3-2µg/mL. Determinamos los valores de la concentración inhibitoria del 50% (IC50) de ambas drogas y evaluamos el efecto de la combinación con el Índice de Combinación (CI: CI>1 antagónico; CI=1 aditivo; CI<1 sinérgico) y graficamos isobologramas a partir de los valores de IC50 de cada una de las drogas y de las combinaciones.  Las alteraciones ultraestructurales de las leishmanias se evaluaron con microscopia electrónica.

El IC50 de ANF fue de 0,018μg/ml y de CLO 1,098μg/ml sobre promastigotes, siendo 25 y 108 veces menor que la concentración citotóxica.  Los valores de IC50 sobre la línea celular Vero fueron 0,44μg/ml para ANF y 119μg/ml para CLO.  El valor del CI de 0,18 indica efecto sinérgico.  Los isobologramas muestran que los IC50 de las combinaciones se ubicaron por debajo de la línea de aditividad, lo que indica un efecto sinérgico entre ANF y CLO, coincidiendo con el resultado obtenido con el índice de combinación.  Estos resultados coinciden con lo observado en las microfotografías, ya que las mayores alteraciones corresponden a las leishmanias tratadas con la combinación.  

El efecto sinérgico observado puede ser resultado de los mecanismos de acción complementarios de ambas drogas, que estarían potenciando el efecto letal, produciendo la muerte del parásito a menores concentraciones que la monoterapia y sin efectos tóxicos evidentes sobre el huésped.